Water Quality Assessment: Determining Dioxin Potency by Means of the CALUX Bioassay.

Dioxines? Niet op mijn bord!

Wie herinnert zich de dioxinecrisis van 1999 niet? Tonnen kippen en zuivelproducten werden toen preventief vernietigd omdat dioxines in de voedselketen waren terechtgekomen. Maar weet je ook wat dioxines zijn en waarom iedereen er schrik van had? Dioxines zijn chemische verbindingen die extreem giftig zijn voor zowel dieren als mensen, zelfs bij zeer lage dosissen. Bovendien zijn het zeer stabiele verbindingen waardoor ze zich kunnen opstapelen in organismen.

Omdat dioxines niet van water houden concentreren ze zich in sedimenten in rivieren en in het slib in afvalwaterzuiveringsinstallaties. Zo vormen ze daar een soort van chemische tijdbom die kan afgaan wanneer de omstandigheden wijzigen. Bij gebruik van slib als meststof in de landbouw kunnen dioxines in de voedselketen geraken. Het is dan ook zeer belangrijk dat de hoeveelheid van dioxines die aanwezig is in sedimenten en in slib op een routinematige manier kan bepaald worden zodat op tijd kan ingegrepen worden.

Gas chromatografie in combinatie met hoge resolutie massa spectrometrie (GC-HRMS) is de standaard referentie methode om de hoeveelheid dioxines in een staal te bepalen. Deze analyse methode is echter zeer duur en tijdrovend en is dus niet geschikt om vele stalen op routinematige basis te analyseren. Om deze problemen te overkomen werd een bioassay ontwikkeld genaamd CALUX (Chemically Activated Luciferase Expression). Dit bioassay maakt gebruik van muizen kankercellen die genetisch gemodificeerd werden zodat ze licht produceren nadat ze in contact zijn gekomen met dioxines. De hoeveelheid licht die wordt geproduceerd is gerelateerd aan de hoeveelheid dioxines in het staal en zo kan een schatting gemaakt worden van de algehele dioxine toxicitiet. Deze biologische analyse methode is sneller en goedkoper dan het chemische alternatief en is daarom geschikter als screenings methode om vele stalen te analyseren.

Ondanks de voordelen van dit bioassay zijn er ook nog steeds enkele methodologische problemen die het routinegebruik ervan in de weg staan. Zo moet de opgemeten lichtproductie worden omgezet naar een schatting van de hoeveelheid dioxines in het staal. Hiervoor wordt de lichtproductie van een referentiestaal bij verschillende concentraties vergeleken met de lichtproductie van het staal, tevens bij verschillende concentraties. Om deze vergelijking te kunnen maken is echter een wiskundig model nodig dat een zo goed mogelijke fit geeft aan de experimenteel opgemeten data. Vaak wordt gebruik gemaakt van de Hill vergelijking om de s-vormige curve te beschrijven. Een andere methode bestaat erin om eerst een Box-Cox transformatie van de punten door te voeren zodat een rechte wordt bekomen in plaats van een s-vormige curve. Dit vergemakkelijkt de verdere berekeningen aangezien het veel makkelijker is om de rechte te vinden die de best mogelijke fit geeft dan om een s-vormige curve te vinden die het best past bij de data. Met mijn experimentele data heb ik kunnen aantonen dat beide berekeningsmethoden hetzelfde resultaat opleveren, maar dat de laatste methode het voordeel heeft dat minder punten moeten worden opgemeten en dat de precisie op het bekomen resultaat ook veel groter is. Om al deze berekingen te automatiseren werd ook een programma geschreven in de Visual Basic editor in Excel. Dit vergemakkelijkt de analyse en laat een zekere uniformisering van het resultaat toe. Er werd gekozen om het programma dynamisch te maken. Dit wil zeggen dat alle berekeningen kunnen worden aangepast aan een verschillende experimentele set-up die de onderzoeker zelf kan aangeven als input in het programma. Dit maakt het programma ook bruikbaar voor verder onderzoek naar dioxines.

Een ander probleem bij het gebruik van het CALUX bioassay is de mogelijkheid tot vergelijking van het bekomen resultaat met het resultaat zoals bekomen met de standaard referentie techniek nl. GC-HRMS. Om deze vergelijking correct te kunnen maken zou hetzelfde staal geanalyseerd moeten worden door beide technieken. Dit is momenteel echter niet het geval. Het probleem is dat het sedimentstaal niet rechtstreeks kan geïnjecteerd worden in de GC-HRMS noch kan het rechstreeks toegediend worden aan de CALUX cellen. Om de analyse van het staal mogelijk te maken dient eerst een extractie van de dioxines te gebeuren. Dit kan men niet zo specifiek doen dat enkel de dioxines worden onttrokken uit het staal en daarom is vervolgens een verwijdering van stoffen die mogelijk kunnen interferen met het resultaat nodig. Deze voorbereiding van het staal (extractie en opzuivering) is verschillend voor beide analyse methoden waardoor een correcte vergelijking tussen beide resultaten niet mogelijk is. Een eventueel verschil kan immers gewoon te wijten zijn aan verschillen in de voorbereiding van het staal. Daarom werd een nieuwe preparatiemethode opgesteld die zowel kan gebruikt worden voor het  analyseren van stalen via GC-HRMS als CALUX. Hiervoor werd gebruikt gemaakt van een bestaande preparatiemethode voor CALUX waaraan een extra stap werd toegevoegd die de zwavel uit het staal haalt. De GC-HRMS analyse is immers zeer gevoelig voor zwavel, een stof die veelvuldig voorkomt in zuurstofarme sedimenten. Er werd gekozen om zwavel uit het staal te halen door een geactiveerde koper kolom te gebruiken. Het zwavel reageert met het koper en vormt een zwarte neerslag van kopersulfide. Deze extra opkuisstap beïnvloed de CALUX cellen niet aangezien hetzelfde resultaat werd bekomen als met de reeds bestaande preparatiemehtode voor CALUX. Door deze gewijzigde staalvoorbereiding te gebruiken kunnen de resultaten van zowel de standaardreferentie methode als de screeningmethode beter met elkaar vergeleken worden.

Tot slot kunnen we stellen dat de resultaten van dit thesisonderzoek bijdragen tot het betrouwbaarder maken van het CALUX bioassay resultaat, een methode die het routinematig analyseren van vele stalen op de aanwezigheid van alarmerende hoeveelheden dioxines mogelijk maakt.