Structural insight into fluorescent protein properties by rational design and characterization of photoconvertible, photoswitchable and phototoxic fluorescent proteins.

Benjamien Moeyaert

Scherper beeld dankzij fluorescente proteïnen.

Wie vandaag langs de kusten van Friday Harbor in Washington wandelt en zich aan een snorkelpartij in het frisse water waagt, heeft veel kans om grote scholen lichtgevende kwallen in het visier te krijgen. Dat was niet anders in de zestiger jaren, toen Osamu Shimomura, een Japans onderzoeker, naar de universiteit van Princeton trok om onderzoek te doen naar deze merkwaardige waterorganismen. Op dat moment had de jonge wetenschapper nog geen flauw benul van het feit dat hij enkele jaren later in deze kwallen een uiterst merkwaardig proteïne zou ontdekken. Het proteïne fluoresceerde met een groene kleur en werd daarom zeer toepasselijk groen fluorescerend proteïne (GFP) genoemd. Al snel werden dergelijke proteïnen bij andere organismen gevonden en bouwde men ze om tot proteïnen die ook blauw, geel of rood fluoresceren. De dag van vandaag kan men geen biologisch lab bezoeken, of men vindt er fluorescerende proteïnen die voor tal van toepassingen worden ingezet.

Een tiental jaar geleden echter, werd het beeld dat onderzoekers van deze proteïnen hadden grondig verstoord door de ontdekking van zogenaamde fotoactiveerbare fluorescerende proteïnen. Men zag dat naarmate men het proteïne langer liet fluoresceren, de groene oplossing naar oranje tot rood evolueerde. Dit onomkeerbaar proces, waarbij een groen fluorescerend proteïne wordt omgezet in een rood fluorescerende vorm, heet fotoconversie. In andere proteïnen zag men dat de fluorescentie steeds zwakker en zwakker werd naarmate men ze langer liet oplichten. Dit proces is reeds lange tijd gekend en wordt fotobleking genoemd. Echter, hoewel fotobleking een onomkeerbaar proces is, konden deze nieuwe proteïnen hun fluorescentie terugwinnen dankzij het instralen van violet licht. Zo kunnen ze meermaals aan- en uitgeschakeld worden en daarom noemen we ze fotoschakelbare fluorescerende proteïnen. Een van de meest bekende fotoschakelbare proteïnen heet Dronpa, genoemd naar de ninja-term “dron”, wat “verschijnen” betekent en waarbij “pa” voor “photo-activation” staat.

Verbeterde microscopie

Tot voor enkele jaren was de resolutie van de meest geavanceerde microscopen gelimiteerd tot 200 nanometer, een vijfduizendste van een millimeter. Dat betekent dat twee punten die minder dan 200 nanometer van elkaar verwijderd zijn, niet als afzonderlijke punten kunnen worden herkend. De golflengte van het zichtbare licht is immers van dezelfde grootte-orde. Vergelijk het met een meterstok; daar kan je geen afstanden van enkele millimeter mee bepalen.

Het labo voor fotochemie en spectroscopie van de Katholieke Universiteit Leuven heeft Dronpa uitvoerig bestudeerd en heeft ontdekt hoe het een zeer interessante tool voor microscopische spitstechnologie kan zijn. Een voorbeeld van een dergelijke techniek is foto-geactiveerde localisatie microscopie (PALM). Deze techniek verloopt als volgt. In een cel waar bijvoorbeeld Dronpa in aangemaakt is, wordt in een eerste stap alle fluorescentie uitgeschakeld. Vervolgens worden willekeurig een aantal proteïnen terug aangezet, zodat elk enkelvoudig proteïne als een helder vlekje wordt herkend. Van dit vlekje wordt het middelpunt berekend en op de computer opgeslagen. De proteïnen worden vervolgens weer uitgeschakeld en het proces begint opnieuw, met het aanschakelen van een aantal andere proteïnen. Deze cyclus gaat door tot men een beeld krijgt van de plaats waar alle afzonderlijke proteïnen zich bevinden. Dit beeld bestaat dan uit vele duizenden afzonderlijke puntjes, die elk afkomstig zijn van een enkel proteïne dat werd aangeschakeld, gedetecteerd en weer uitgeschakeld. Doordat elk molecule afzonderlijk werd gedetecteerd, is de resolutie van deze techniek tot tien keer beter dan wat voorheen mogelijk was.

Hoewel bovenstaande aanpak bijzonder elegant in de oren klinkt, zijn de technologische vereisten voor dergelijke experimenten groot. Geavanceerde lasers, een gesofisticeerde microscoop, een trilvrije tafel, hoogtechnologische lenzen en peperdure camera’s zijn een eerste stap. Een tweede, minstens zo cruciale factor is de keuze van het fotoactiveerbaar fluorescerend proteïne. Dronpa bijvoorbeeld was een geslaagde eerste stap, maar het kan nog beter. Veel beter.

Verbeterde fluorescerende proteïnen

Ons onderzoek spitste zich toe op het verbeteren van de parameters van fluorescerende proteïnen met het oog op superresolutiemicroscopie. Door het gedetailleerd bestuderen van de atomaire structuren van zowel fotoschakelbare als fotoconverteerbare fluorescerende proteïnen, zijn we erin geslaagd de elementen, die aanleiding geven tot deze processen, te identificeren. En we gingen nog verder. We leerden deze merkwaardige proteïnen zo goed kennen, dat het mogelijk werd hun dynamische eigenschappen in niet-fotoactiveerbare proteïnen in te brengen. Het neusje van de zalm was het combineren van fotoschakelbare en fotoconverteerbare eigenschappen in een enkel proteïne, dat we NijiFP noemden—Niji is het Japanse woord voor regenboog.

De mogelijkheden die NijiFP voor ultramoderne microscopische experimenten schept, zijn niet te overzien. Dankzij de fotoconverteerbare eigenschappen kan men bijvoorbeeld in een genetisch gemodificeerde menselijke cel een regio van groen naar rood converteren. Vervolgens worden afzonderlijk de beweging van de rode en groene moleculen in hoge resolutie gevolgd. NijiFP zorgt er dus voor dat men niet alleen de localisatie, maar ook de beweging van moleculen in hoge resolutie kan volgen. De veelheid aan toepassing binnen het biologisch en biomedisch veld zijn dan ook niet te overzien. Het staat buiten kijf dat de PALM-technologie, mede dankzij dit sterk verbeterde proteïne, snel zijn weg zal vinden naar het onderzoek in bedrijven en universiteiten, overal ter wereld.

<start kader-inzet>

Kan kanker worden genezen met licht?

Een merkwaardige en onverwachte toepassing van fluorescerende proteïnen is het gebruik ervan in de strijd tegen kanker. Bepaalde van die proteïnen, zoals het rode proteïne dat heel toepasselijk KillerRed werd gedoopt, fluoresceren niet alleen, ze produceren ook grote hoeveelheden reactieve zuurstofdeeltjes wanneer men er licht op instraalt. Deze deeltjes vernielen alle moleculen waar ze op inbotsen en doden zo de cel waarin ze zich bevinden.

Op die manier kunnen we werken aan een middel tegen kanker. Fluorescerende proteïnen die we specifiek in kankerweefsel tot expressie laten komen, kunnen  dat weefsel selectief vernielen dankzij het zogenaamde twee-foton excitatie effect. Deze techniek maakt gebruik van sterk gefocuste maar niettemin volkomen ongevaarlijke lichtbundels.

Hoewel deze aanpak bijzonder beloftevol is, is het rode KillerRed ongeschikt voor de twee-foton techniek. Ons onderzoek gaf reeds een aantal waardevolle aanzetten naar de ontwikkeling van groene varianten. Deze zijn wel bruikbaar voor deze toepassing en zullen na verloop van tijd hun weg naar therapeutische toepassingen vinden.

<eind kader-inzet>