Identificatie van genomische groepen binnen het genus Stenotrophomonas & ontwikkeling van een nieuw Burkholderia cepacia selectief medium

Elke Vanlaere
 
&
ontwikkeling van een nieuw Burkholderia cepacia selectief medium
 
Mucoviscidose of cystic fibrosis is de meest voorkomende erfelijke ziekte bij blanken. Ze wordt veroorzaakt door mutaties ter hoogte van het cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gen.  Deze mutatie leidt tot een slecht functionerend CFTR eiwit dat in gezonde mensen onder andere het transport van zouten en water regelt en er dus voor zorgt dat slijmlagen gehydrateerd blijven. Het basisdefect is opvallend merkbaar in de exocriene klieren door abnormaal dik, kleverig en taaie secreties.

Identificatie van genomische groepen binnen het genus Stenotrophomonas & ontwikkeling van een nieuw Burkholderia cepacia selectief medium

 

&

ontwikkeling van een nieuw Burkholderia cepacia selectief medium

 

Mucoviscidose of cystic fibrosis is de meest voorkomende erfelijke ziekte bij blanken. Ze wordt veroorzaakt door mutaties ter hoogte van het cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gen.  Deze mutatie leidt tot een slecht functionerend CFTR eiwit dat in gezonde mensen onder andere het transport van zouten en water regelt en er dus voor zorgt dat slijmlagen gehydrateerd blijven. Het basisdefect is opvallend merkbaar in de exocriene klieren door abnormaal dik, kleverig en taaie secreties. De patiënten hebben hoofdzakelijk te kampen met spijsverteringsproblemen, darmverstoppingen, longproblemen en infertiliteit. De aandoening is tot op heden ongeneeslijk en op termijn dodelijk. Door de betere behandelingsmethoden bedraagt de levensverwachting van deze patiënten nu iets meer dan dertig jaar. De ultieme uitdaging is nog steeds mucoviscidose genezen, waarbij op vlak van gentherapie reeds hoopgevende resultaten behaald zijn.

 

In de meeste gevallen zijn de longinfecties de oorzaak van een vroegtijdige dood. In een gezonde long produceren bekercellen in het slijmvlies een slijmlaag die microben en stofdeeltjes opvangt. Door de beweging van de trilhaartjes in de long wordt het slijm naar de keel gebracht en daar uitgespuwd of ingeslikt. Door het viskeuze slijm bij mucoviscidosepatiënten valt de golfbeweging van de trilhaartjes stil, waardoor alles blijft hangen in de longen. Daardoor verstoppen luchtpijpvertakkingen en vormt het achterblijvende slijm een ideale omgeving voor opportunistische pathogene bacteriën1. De infecties gaan gepaard met perioden van ziekten afgewisseld met periodes van relatieve gezondheid. Tijdens elke ziekteperiode takelen de longen meer af. De meest voorkomende organismen die de infecties veroorzaken zijn Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Haemophilus influenzae, organismen van het Burkholderia cepacia  complex en Stenotrophomonas maltophilia.

 

B. cepacia werd het eerst beschreven door Walter Burkholder als een fytopathogeen organisme. Het is een aëroob, Gram-negatief, staafvormige bacterie. De isolaten geïdentificeerd als B. cepacia behoren eigenlijk tot meerdere species, waarbij men spreekt over het B. cepacia complex. Sinds de jaren ’80 worden steeds meer gevallen gemeld van mucopatiënten die gekoloniseerd worden door het B. cepacia complex, een groep bacteriën die voor andere mensen vrij ongewone ziekenhuispathogenen zijn. Hoewel het resultaat van een B. cepacia complex kolonisatie op de algemene gezondheidstoestand van de patiënten variabel is, hebben deze bacteriën een dramatische invloed op de levensverwachting van de patiënten en elke besmetting kan verregaande medische, sociale en psycho-sociale gevolgen hebben. De bacterie kan bovendien ook gebruikt worden als biocontrole2 en bioremediëringsagens3, wat misschien een potentieel gevaar betekent voor de patiënten. Zolang men geen zekerheden heeft omtrent deze zaken is het verboden deze organismen te gebruiken in het milieu.

 

De epidemiologie4 van B. cepacia infecties is nog onvolledig gekend. Drastische infectiecontrolemaatregelen hebben de overdracht van patiënt naar patiënt sterk doen afnemen, maar tegelijkertijd steeg het aandeel van de besmetting door andere bronnen, zoals waarschijnlijk grond en water waarin de bacteriën van nature voorkomen. Het gebrek aan specifieke isolatiemedia maakt het echter zeer moeilijk om de exacte besmettingsbronnen in het leefmilieu van de patiënten te identificeren. In het kader van deze problematiek werd in de thesis een nieuw selectief medium5 samengesteld op basis van de component C-3906. Vooreerst werd de ideale C- en N- bron concentratie bepaald (arabinose en threonine), vervolgens werd een antibioticamix en de optimale concentratie van de selectieve component C-390 getest en daaropvolgend werden de kwaliteit van het medium en de gebruikte isolatieprotocollen (rechtstreeks uitplaten, aanrijken7 en aanrijken na filtratie van het waterstaal) onderzocht en werd de minimale detectielimiet8 van het medium bepaald. De kwaliteit en de minimale detectielimiet werden onderzocht met spike-experimenten waarbij de opzet is dat men de bacterie toevoegt aan een waterstaal en vervolgens test of deze opnieuw geïsoleerd kan worden door het selectief medium. Uit de resultaten blijkt dat het medium selectief en gevoelig is en betere resultaten bekomen worden als de stalen eerst aangerijkt worden. Het heeft bijgevolg zin het verder te onderzoeken en op punt te stellen.

 

Stenotrophomonas maltophilia is een aëroob, Gram-negatief en niet sporulerend organisme. Het wordt gebruikt als een biocontrole en bioremediëringsagens, maar is tevens ook berucht als een pathogeen die verantwoordelijk is voor nosocomiale9 infecties. S. maltophilia wordt de laatste 15 jaar steeds meer teruggevonden in de respiratoire secreties van mucoviscidosepatiënten. Momenteel is er nog maar zeer weinig geweten over de virulentie, invloed op de levensverwachting van de patiënten, transmissie en het natuurlijk reservoir van deze bacterie. In de thesis wordt de taxonomie van Stenotrophomonas species onderzocht met behulp van PCR10-gesteunde restrictiefragment lengte polymorfisme (RFLP) van het gyrase B11 gen. In deze techniek wordt het PCR geamplificeerde gen met restrictie-enzymen12 geknipt en na gelelektroforese13 verkrijgt men een specifiek bandenpatroon dat met de computer wordt verwerkt. Stammen uit een vorige taxonomische studie (Hauben et al., 1999) en een hoop recent klinische isolaten zullen onderzocht worden naar de genomische groepen binnen het genus en waar nodig zullen DNA-DNA hybridisaties14 uitgevoerd worden om op basis van verwantschap tussen stammen de verkregen clustering te bevestigen en vroeger bekomen waarden te herevalueren. De methode is eenvoudig, snel en, niet onbelangrijk, reproduceerbaar15. In het dendrogram16 werden negen clusters onderscheiden met een interne similariteit van >70%. De bekomen hybridisatiewaarden binnen een groepje liggen algemeen hoger dan tussen twee groepjes, maar de vaak hoge standaarddeviaties duiden op de grote genomische diversiteit in het genus. 59% van de stammen geïsoleerd uit mucoviscidosepatiënten werden teruggevonden in een zelfde groep. Deze vaststelling kan van belang zijn voor verder onderzoek omtrent virulentie en transmissie. De gyrB-RFLP lijkt veelbelovend te zijn, maar de methode zal maar definitief geëvalueerd kunnen worden na bijkomende hybridisaties die noodzakelijk zijn om de ontbrekende waarden aan te vullen en afwijkende waarden te controleren.

 

De meerderheid van de bevolking heeft wel al gehoord over mucoviscidose, maar de minderheid is op de hoogte van wat de ziekte precies inhoudt en wat sommige bacteriën ermee te maken hebben. Via deze samenvatting hoop ik die minderheid wat uit te breiden. Hopelijk opent het onderzoek -van welke aard ook- nieuwe deuren voor deze patiënten…

 

Universiteit of Hogeschool
biotechnologie
Publicatiejaar
2003
Share this on: