Optische analyse van mitochondriaal transport in zenuwuitlopers

Alzheimer, ALS, Parkinson … Wat is er mis met de zenuwcel?

Verschillende ziekten, zoals Alzheimer, ALS, Parkinson en de ziekte van Charcot-Marie-Tooth, …, hebben als gevolg dat zenuw- of hersencellen niet meer goed werken. Wetenschappers zoeken naar de oorzaken. Daarom wordt onderzocht hoe die cellen werken. Met die resultaten hoopt men wat verder op de weg te zijn naar een genezing van deze ziekten.

In de cel zijn allerlei mechanismen en materialen aanwezig om het celhuishouden te beredderen. Zo vinden we er onder andere mitochondriën. Hun taak bestaat er in energie te produceren. Zij worden, zoals een vracht op een wagonnetje over sporen, verplaatst binnenin de cel. Omdat zenuwcellen heel lang kunnen zijn - soms tot één meter lang - moeten de mitochondriën vaak ver reizen doorheen de tentakels van de zenuwcel om hun bestemming te bereiken. Wetenschappers denken dat blokkades of haperende transporten misschien een oorzaak kunnen zijn van het niet goed werken van deze zieke zenuwcellen.

Hoe meten?

Meten is weten. Daarom hebben we eerst onderzocht hoe dit transport verloopt. De mitochondriën werden gefilmd met een camera op een fluorescentiemicroscoop. Een fluo­rescen­tie­microscoop is een microscoop die éénkleurig licht, bijvoorbeeld blauw, op de cellen laat schijnen. Dit licht valt op een fluorescerende ‘verf’, Mitotracker Green genoemd, waarmee de mitochondriën gekleurd werden. De fluorescerende verf reflecteert dan een ander éénkleurig licht, zoals groen, dat opgevangen wordt door de microscoopcamera.

Van deze filmpjes maakten we dan informatiekaarten: tijd/ruimte-kaarten. Deze kaarten combineren een tijdslijn met een plaatsaanduiding zoals bij een wegenkaart. Met deze informatiekaarten hebben we verschillende snelheden van de mitochondriën berekend, hun richtingveranderingen geteld en gegevens verzameld over mitochondriën die niet bewogen, nl. hoe lang ze niet bewogen en waar ze zich dan bevonden. We deden dit voor drie soorten cellen (uit de darmwand van een muis) waarvan zenuwcellen ons dus het meest interes­seer­den.

Er werd vastgesteld dat er in de zenuwcellen minder mitochondriën van richting veranderden en er meer ‘rechtstreeks’ getransporteerd werden dan in andere celsoorten. Opvallend voor de zenuwcellen was de gelijkmatige verdeling van ‘geparkeerde’ mitochondriën in de uitlopers van de zenuwcellen. De afstand tussen ‘geparkeerde’ mito­chon­driën bedroeg meestal 3,5 micrometer (één miljoenste van een meter). De gemeten snelheden lagen tussen 0 en 1 micrometer per seconde. We hebben ook enkele specifieke trans­portfenomenen waargenomen in onze video-opnames: zo verhinderde een prop mitochondriën in een bepaalde opname het transport.

Storingen

Het herkennen van de celsoort en van de cel waar een mitochondrion bij hoort is echter niet eenvoudig omdat de fluorescerende ‘verf’ mitochondriën van alle aanwezige cellen kleurt. Er worden ook nog andere deeltjes dan mitochondriën gekleurd en die geven storing in de video-opnames. Om deze moeilijkheden te verhelpen hebben we een aantal transfecties uitgevoerd. In plaats van de cellen te kleuren van buitenaf, wordt er bij transfectie DNA ingebracht bij sommige cellen. Het DNA bevat een instructie om fluorescerende ‘verf’ te produceren. Dit gebeurt enkel in een klein aantal cellen dat het DNA opgevangen heeft. Het is ook mogelijk om een instructie in het DNA aan te brengen zodat de ‘verf’ enkel in één bepaalde soort cel aangemaakt wordt. Op deze manier hebben we aangetoond dat betere video-opnames kunnen bekomen worden dankzij de methode van DNA-transfectie. Een nadeel is wel dat het een tijdrovende techniek is in vergelijking met de eerst genoemde techniek.

Energieproductie en transport

In een tweede reeks experimenten hebben we onderzocht of er een verband bestaat tussen de functie (het produceren van energie) en het transport van mitochondriën. Om te kleuren hebben we hier TMRE gebruikt. TMRE kleurt - net als Mitotracker Green - de mitochondriën, maar de sterkte van het uitgezonden licht geeft hun (ladings)toestand weer. Deze toestand is een aanduiding voor de mate van produceren van energie van het mitochondrion. De exacte werking van TMRE is nog niet volledig bekend. Ondanks dat we een verband vermoedden, hebben we dit niet kunnen aantonen. Waarschijnlijk is de kennis over de werking van TMRE nog te beperkt op dit ogenblik. We hebben wel computermethodes ontwikkeld die ook in de toekomst kunnen gebruikt worden om dergelijke verbanden te vinden.

Automatiseren

Een derde onderdeel van de thesis handelt over een computerprogrammaatje - gereedschap bij een bestaand programma - dat we hebben ontwikkeld om automatisch de sporen van mitochondriën aan te duiden in de tijd/ruimte-kaarten. Elk mitochondrion heeft een spoor in de tijd/ruimte-kaart. Wanneer een onderzoeker de snelheden van honderden of duizenden mitochondriën wilde analyseren en daarbij alle sporen handmatig diende aan te duiden, nam dit héél veel tijd in beslag. Dankzij dit automatische systeem kunnen onderzoekers tot drie kwartier uitsparen per 100 mitochondriën en toch dezelfde nauwkeurigheid behouden als een onderzoeker die ervaren is in het manueel aanduiden. Voor mitochondriën die veel en snel van richting veranderen is de automatische aanduiding vaak nauwkeuriger dan de manuele. Wanneer de onderzoeker het automatisch resultaat wil aanpassen over een beperkt stukje van het spoor kan hij dit doen, zowel manueel als automatisch, door gebruik te maken van verschillende aanpassingsparameters die we aan het ‘gereedschap’ hebben toegevoegd. Dit programmaatje wordt nu gebruikt door verschillende onderzoekers van meerdere vakgroepen die het transport van mitochondriën of andere deeltjes binnen een cel, onderzoeken.

Dit werk kwam tot stand in het Laboratory for Enteric NeuroScience (LENS), campus Gasthuisberg, KULeuven. Promotor:Prof. Pieter Vanden Berghe. Begeleiding: Marjan Dondeyne.