Moleculaire diagnostiek toegepast op spierdystrofieën: Mutatieanalyse, screening en prenatale diagnostiek

Jens Van Bouwel
Exoomdata werden opnieuw geanalyseerd in het kader van de uitbreiding van een genpanel van 31 naar 141 genen, hierbij werd 1 nieuwe mutatie ontdekt. Verder werd een screening gedaan op zoek naar een nieuw ontdekte mutatie in COL6A1. Tot slot werd getracht de PGD-procedure te optimaliseren.

Hoe één letter een leven verandert

In 2015 leden ongeveer 200 Belgen aan erfelijke bekkengordeldystrofie of LGMD (Limb-Girdle Muscular Dystrophy), maar een groot deel van hen wist dit niet. Artsen kunnen enkel met klinisch onderzoek niet altijd de LGMD-subtypes en andere aanverwante spierziekten van elkaar onderscheiden. Genetische diagnostiek dient dan als laatste reddingsboei, maar hoe gebeurt dit nu juist?

 

Genetica en telefoonboeken

 

3 miljard letters (basen) vormen samen het menselijke genoom en bevatten alle erfelijke informatie. Er zouden maar liefst 200 telefoonboeken van 1000 bladzijden nodig zijn om alle letters na elkaar te plaatsen, maar in elke cel liggen ze netjes verdeeld over 23 chromosomen. Van elk van onze chromosomen hebben we 2 exemplaren: één set van elke ouder. Chromosomen bevatten genen die coderen voor eiwitproducten. Kleine variaties in een gen maken ons verschillend van elkaar: denk maar aan oog- of haarkleur. Deze varianten zijn even functioneel: met blauwe ogen kan je normaal even goed zien als met bruine. Toch bestaan er ook slechtere varianten: wanneer door een foutje op een welbepaalde plaats een deel van de genetische code anders is dan “normaal”, hypothekeert dit wél de kwaliteit van het product waarvoor het gen codeert. In dat geval spreken we van een mutatie. Van heel wat ziekten weten we intussen welk gen, of soms zelfs welke mutatie in dat gen, de ziekte veroorzaakt.

 

Duizelingwekkende cijfers

 

Wanneer u een genetisch onderzoek ondergaat, wordt uw genetisch materiaal hoogstwaarschijnlijk geanalyseerd door één van de 8 Belgische genetische centra, zoals het Gentse CMG. Meestal volstaat een bloedstaal, maar soms is een biopsie van het aangetaste weefsel, zoals spierweefsel, noodzakelijk. De komst van de next-generation sequencing (NGS) technologie luidde een tijdperk in waarin veel stalen tegelijk uitgebreid en (relatief) goedkoop onderzocht kunnen worden. Afhankelijk van de aandoening vraagt de arts om de volledige sequentie van de coderende gedeelten van alle genen (whole exome sequencing), of van de coderende gedeelten van een aantal genen te bepalen. Op enkele uren tot dagen kan een NGS-toestel elk van de 3 miljard letters tientallen keren lezen. Probeer dat maar eens met 200 telefoonboeken!

 

Deze stortvloed aan data analyseren is de eigenlijke snelheidsbepalende stap. De data van een volledig exoom worden niet meteen volledig geanalyseerd, maar blijven beschikbaar voor heranalyse wanneer er nieuwe inzichten bekendraken. Door het aantal te onderzoeken genen verder te beperken tot een panel met genen die een gekende link hebben met een ziekte, versnelt men het analyseproces nog meer. De Gentse genetici gebruiken voor de diagnostiek van erfelijke spierziektes een genpanel van 141 genen. Zelfs uit dit “kleine” panel (141 van de 20 000 genen) oogst men nog steeds tienduizenden varianten. Gelukkig bestaan er handige filters om alle “onschuldige” varianten tegen te houden, zodat de aandacht kan gaan naar de jacht op mogelijke boosdoeners. Deze mogelijk “interessante” varianten worden bevestigd met een andere methode om de kans op vals-positieve resultaten te verkleinen. Belgische centra hebben nauwelijks vals-positieve resultaten, maar helaas lijken andere (buitenlandse) labo’s soms lakser met deze bevestigingsstap om te springen, mogelijk met foute rapporteringen tot gevolg.

 

Soms levert diagnostiek nieuwe inzichten aan onderzoek: zo vonden we in het BVES-gen van een Gentse patiënt een nooit eerder beschreven mutatie. Eén foute base op een cruciale plek leidt tot een gen dat niet wordt vertaald naar een eiwitproduct. Onderzoekers kunnen nu het effect van een “uitgeschakeld” BVES-gen bestuderen in een mens, in plaats van dit gen kunstmatig uit te schakelen in een dier. Dit is zonder twijfel een schoolvoorbeeld van een “interessante” variant!

 

Ik heb een genetische ziekte, wat nu?

 

Helaas kan men patiënten (nog) niet genezen van erfelijke ziektes, maar de juiste opvolging is cruciaal om de levensverwachting en -kwaliteit te waarborgen. Concreet voor LGMD-patiënten kan het gaan van aangepaste kinesitherapie tot het inplanten van een pacemaker.

 

Sommige patiënten die hun diagnose krijgen, hebben een kinderwens. Zij worstelen vaak met een dilemma, omdat er een aanzienlijke kans bestaat dat hun kindje hun ziekte erft. Onder bepaalde voorwaarden kunnen zij beroep doen op PGD of pre-implantatie genetische diagnostiek. Bij embryo’s van 5 dagen oud worden enkele cellen weggenomen, die onderzocht worden om te zien of ze de gekende mutatie van (één van) de ouders dragen. Het staalvolume is beperkt, waardoor er geen tweede poging mogelijk is indien de test niet aanslaat. Daarom zoeken de laboranten eerst naar de meest ideale testcondities door een optimalisatie met witte bloedcellen van de ouders in spe. Pas daarna worden de embryonale cellen onderzocht. Indien de mutatie niet gevonden wordt, weet men dat het embryo geen risico loopt om dezelfde ziekte van zijn ouders te erven. Dit sluit niet uit dat het kindje andere (erfelijke) ziektes kan hebben!

 

Het Gentse centrum mikt op een verdere uitbreiding van het PGD-aanbod, maar daarvoor moeten  eerst enkele hindernissen overwonnen worden. Momenteel worden de bloedcellen op ambachtelijke wijze uit een celcultuur gepikt, wat de capaciteit van het labo drukt. Dit probeerden we te vervangen door een gebruiksvriendelijker alternatief. Helaas moesten de labomedewerkers concluderen dat het uitgedachte protocol niet voldeed, waardoor de oude methode nog in voege blijft.

Een andere voorwaarde is de validatie van een testkit die nog vóór de “echte” analyse reeds het genetische materiaal vermeerdert. Op die manier kan men wél meerdere testen doen uit een beperkte starthoeveelheid. Een logische vereiste is dat deze kit 100% betrouwbaar het materiaal vermeerdert, zo niet bestaat de kans dat de kit net op de plaats van een mutatie een foute letter inbouwt. Daarnaast is het ook belangrijk dat de regio rond de mutatie goed wordt geamplificeerd, omdat het anders kan lijken alsof de mutatie niet aanwezig is. Deze ontwikkelingen zijn nog in een testfase.

 

De toekomst: mega, giga, tera, ...?

 

Stilstaan is achteruitgaan, ook voor het CMG Gent. De uitbreidingsplannen tonen de langetermijnvisie om ook de patiënt van morgen beter te helpen. De NGS-revolutie maakte genetisch onderzoek al grootschalig en betaalbaar(der), nu focust de ontwikkeling van nieuwe toestellen (en bijhorende voorvoegsels voor de eenheden) op een verdere prijsdaling. Mogelijk heb je ooit het volledige genoom van enkele mensen voor de prijs van de nieuwste iPhone! 

Bibliografie

ATD Bio. (sd). ATD Bio. Opgehaald van Sequencing, Forensic Analysis and Genetic Analysis: http://www.atdbio.com/content/20/Sequencing-forensic-analysis-and-genet…

Big Picture. (2014, December). Big Picture. Opgehaald van Whose rights? Genetic testing before birth: https://bigpictureeducation.com/whose-rights-genetic-testing-birth

Biological Industries. (sd). Phytohemagglutinin-M (PHA-M), Liquid. Opgehaald van Biological Industries: http://www.bioind.com/phytohemagglutinin-m-pha-m-liquid/

Bönnemann, C. G. (2011). The collagen VI-related myopathies: Ullrich congenital muscular dystrophy and Bethlem myopathy. In R. C. Griggs, & A. A. Amato, Muscular Dystrophies (pp. 81-96). Amsterdam: Elsevier.

Braem, C. (2016). Diagnostische enzymen. In C. Braem, Cursus Klinische Chemie Theorie ML3 (pp. 18-21).

Braem, C. (2016). Next Generation Sequencing. In C. Braem, Moleculaire Biologie theorie 3BL. Hoboken: Karel de Grote Hogeschool.

Capalbo, A., Rienzi, L., Cimadomo, D., Maggiulli, R., Elliott, T., Wright, G., . . . Ubaldi, F. M. (2014). Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction, 1173-1181.

Chang, R. F., & Mubarak, S. J. (2012). Pathomechanics of Gowers' Sign. Clinical orthopaedics and related research, 1987-1991.

Cummings, B. B., Marshall, J. L., Tukiainen, T., Lek, M., Donkervoort, S., Foley, A. R., . . . MacArthur, D. G. (2016, September 8). Improving genetic diagnosis in Mendelian disease with transcriptome sequencing. Opgehaald van Biorxiv: http://biorxiv.org/content/early/2016/09/09/074153

De Jaegere, S., Vereecke, I., & Baetens, M. (2016). Primerdesign voor Ford: geautomatiseerd en manueel. Gent: UZ Gent.

De Leeneer, K. (2016). FORD algemeen protocol: PCR en sequeneren volgens de FORD-workflow. Gent: Centrum voor Medische Genetica Gent.

Don Quijote. (2011, Maart 22). Don Quijote Spanish Language Learning. Opgehaald van First baby born in Spain without a gene associated with cancer: http://blog.donquijote.org/2011/3/first-baby-born-in-spain-without-a-ge…

Donkervoort, S., Hu, Y., Stojkovic, T., Voermans, N., Foley, A. R., Leach, M. E., . . . Bönnemann, C. G. (2015). Mosaicism for dominant collagen VI mutations as a cause for intra-familial phenotypic variability. Human Mutation, 48-56.

Duchenne, G. (1868). Recherches sur la paralysie musculaire pseudohypertrophique ou paralysie myosclerotique. Archives Générales de Médecine, 5-25.

Ehmsen, J., Poon, E., & Davies, K. (2002). The dystrophin-associated protein complex. Journal of Cell Science, 2801-2803.

Epo Medicine. (2016, November 12). Gowers' Sign. Opgehaald van Epo Medicine: http://epomedicine.com/clinical-medicine/gowers-sign/

Fester, N. (2005, November 7). PCR Lab. Opgehaald van University of Las Vegas: https://faculty.unlv.edu/wmojica/PCR_LAB2.htm

Firman, G. (2009, Maart 23). Medical Research Council (MRC) Scale for Muscle Strength. Opgehaald van Medical Criteria: http://www.medicalcriteria.com/site/home/64-neurology/238-neuromrc.html

Fitzgerald, J., Rich, C., Zhou, F. H., & Hansen, U. (2008). Three Novel Collagen VI Chains, alpha4 (VI), alpha5 (VI) and alpha6 (VI). Journal of Biological Chemistry, 20170-20180.

Goderis, N. (2015). Isolatie van lymfocyten uit vers bloed. Gent: UZ Gent.

Green, R. C., Berg, J. S., Grody, W. W., Kalia, S. S., Korf, B. R., Martin, C. L., . . . Biesecker, L. G. (2013). ACMG recommendations for reporting of incidental findings in clincal exome and genome sequencing. Genetics in Medicine, 565-574.

Groulx, J.-F., Gagné, D., Benoit, Y. D., Martel, D., Basora, N., & Beaulieu, J.-F. (2011). Collagen VI is a basement membrane component that regulates epithelial cell–fibronectin interactions. Matrix Biology, 195-206.

Iyadurai, S. P., & Kassar, D. (2014). Limb-Girdle Muscular Dystrophies. In B. Katirji, H. J. Kaminski, & R. L. Ruff, Neuromuscular Disorders in Clinical Practice (pp. 1193-1211). New York: Springer-Verlag New York.

Jöbsis, G. J. (1999). Collagen VI mutations in Bethlem myopathy (PhD thesis). Amsterdam: Universiteit van Amsterdam.

Junqueira, L. C., & Carneiro, J. (2007). Bindweefsel. In L. C. Junqueira, & J. Carneiro, Functionele Histologie (pp. 117-148). Maarssen: Elsevier gezondheidszorg.

Junquiera, L. C., & Carneiro, J. (2007). Spierweefsel. In L. C. Junquiera, & J. Carneiro, Functionele Histologie (pp. 265-286). Maarssen: Elsevier gezondheidszorg.

Kalia, S. S., Adelman, K., Bale, S. J., Chung, W. K., Eng, C., Evans, J. P., . . . Miller, D. T. (2017). Recommendations for reporting of secondary findings in clinical exome and genome sequencing, 2016 update: a policy statement of the American College of Medical Genetics and Genomics. Genetics in Medicine, 249-255.

Kaplan, J.-C., & Hamroun, D. (2015). The 2016 version of the gene table of monogenic neuromuscular disorders (nuclear genome). Neuromuscular Disorders, 991-1020.

Kapustin, Y., Chan, E., Sarkar, R., Wong, F., Vorechowsky, I., Winston, R. M., . . . Dibb, N. J. (2011). Cryptic splice sites and split genes. Nucleic Acids Research, 5837-5844.

Kniffin, C. L. (2016, Februari 12). OMIM #616812. Opgehaald van Muscular Dystrophy, Limb-Girdle, Type 2X; LGMD2X: https://www.omim.org/entry/616812

Kniffin, C. L. (2016, Augustus 13). OMIM #617072. Opgehaald van Muscular Dystrophy, Limb-Girdle, Type 2Y; LGMD2Y: https://www.omim.org/entry/617072

Kniffin, C. L. (2016, December 1). OMIM #617232. Opgehaald van Muscular Dystrophy, Limb-Girdle, Type 2Z; LGMD2Z: https://www.omim.org/entry/617232

Lampe, A. K., Flanigan, K. M., Bushby, K. M., & Hicks, D. (2012, Augustus 9). Collagen Type VI-Related Disorders. Opgehaald van GeneReviews: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1503/?report=classic

Larner, A. J. (2016). Gowers' Manoeuvre, Gowers' Sign. In A. J. Larner, A Dictionary of Neurological Signs (p. 142). Springer.

Lu, Y., Shen, Y., Warren, W., & Walter, R. (2016, Januari 14). Intech Open. Opgehaald van Next Generation Sequencing in Aquatic Models: https://www.intechopen.com/books/next-generation-sequencing-advances-ap…

Mills, K. R. (2005). The Basics of Electromyography. Journal of Neurology, Neurosurgery and Psychiatry, ii32-ii35.

Mitsuhashi, S., & Kang, P. B. (2012). Update on the Genetics of Limb Girdle Muscular Dystrophy. Seminars in Pediatric Neurology, 211-218.

Muscles Used. (sd). Gastrocnemius & Soleus (Calf). Opgehaald van Muscles Used: http://www.musclesused.com/gastrocnemius-soleus-calf-muscles/

Narayanaswami, P., Weiss, M., Selcen, D., David, W., Raynor, E., Carter, G., . . . Amato, A. A. (2014). Evidence-based guideline summary: Diagnosis and treatment of limb-girdle and distal dystrophies. Neurology, 1453-1463.

Nigro, V., & Savarese, M. (2014). Genetic basis of limb-girdle muscular dystrophies: the 2014 update. Acta Myologica, 1-12.

Paganoni, S., & Amato, A. (2013). Electrodiagnostic Evaluation of Myopathies. Physical medicine and rehabilitation clinics of North America, 193-207.

Pegoraro, E., & Hoffman, E. P. (2012, Augustus 30). Limb-Girdle Muscular Dystrophy Overview. Opgehaald van GeneReviews (R): https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1408/#_NBK1408_pubdet_

Presidential Commission for the Study of Bioethical Issues. (2016, Oktober 30). For Researchers: Incidental and Secondary Findings. Opgehaald van Bioethics Archive Georgetown University: https://bioethicsarchive.georgetown.edu/pcsbi/sites/default/files/Resea…

Reed, U. C. (2009, Juni). Congenital muscular dystrophy. Part II: a review of pathogenesis and therapeutic perspectives. Opgehaald van SciELO, Arquivos de Neuro-Psiquiatria: http://www.scielo.br/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0004-282X200900…

Richards, S., Aziz, N., Bale, S., Bick, D., Das, S., Gastier-Foster, J., . . . Rehm, H. L. (2015). Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology. Genetics in Medicine, 405-424.

Russell, J. W., Weiss, M. D., Distad, B. J., & Castellani, R. J. (2014). Muscle and Myotonic Diseases. In E. L. Feldman, W. Grisold, J. W. Russell, & W. N. Löscher, Atlas of Neuromuscular Diseases: A Practical Guideline (pp. 247-281). Wien: Springer-Verlag.

Sabatelli, P., Gualandi, F., Gara, S. K., Grumati, P., Zamparelli, A., Martoni, E., . . . Wagener, R. (2012). Expression of collagen VI alpha 5 and alpha6 chains in human muscle and in Duchenne muscular dystrophy-related muscle fibrosis. Matrix Biology, 187-196.

Schindler, R. F., Scotton, C., Zhang, J., Passarelli, C., Ortiz-Bonnin, B., Simrick, S., . . . Ferlini, A. (2016). POPDC1 (S201F) causes muscular dystrophy and arrhythmia by affecting protein trafficking. The Journal of Clinical Investigation, 239-253.

Seq Answers forum. (20, November 2012). Seq Answers forum. Opgehaald van Primer design Universal tailed Amplicon: http://seqanswers.com/forums/showthread.php?t=25128

Shoulderdoc. (2016, Februari 11). Winging Scapula. Opgehaald van Shoulderdoc: https://www.shoulderdoc.co.uk/section/492

Sigma Aldrich. (sd). Fetal Bovine Serum. Opgehaald van Fetal Bovine Serum: http://www.sigmaaldrich.com/life-science/cell-culture/cell-culture-prod…

Stevenson, A. C. (1953). Muscular Dystrophy in Northern Ireland: I. An account of the condition in fifty-one families. Annals of Eugenics, 50-93.

Symoens, S., Van Acker, P., & Van Holm, E. (sd). Pre-implantatie Genetische Diagnostiek (PGD) voor monogene aandoeningen (ongepubliceerde versie).

Thermo Fisher Scientific. (sd). Thermo Fisher Scientific. Opgehaald van DTT (dithiothreitol): Description: https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0861

U.Z. Brussel Centrum voor Medische Genetica. (2016, December 21). Overerving. Opgehaald van Centrum voor Medische Genetica UZ Brussel: http://www.brusselsgenetics.be/moza%C3%AFcisme_nl?doscroll=true#L4-5107

U.Z. Leuven. (2015, Januari 16). Scoliose bij kinderen. Opgehaald van Website van de dienst orthopedie van het UZ Leuven: https://www.uzleuven.be/nl/scoliose-bij-kinderen

Veloso de Albuquerque, M. A., Neto, O. A., Alencar da Silva, F. M., Zanotelli, E., & Reed, U. C. (2015). Limb-girdle muscular dystrophy type 2A in Brazilian children. Arquivos de Neuro-Psiquiatria, 993-997.

Vereecke, I. (2014). Cycle sequencing manueel. Gent: Centrum Medische Genetica Gent.

Vlaamse Centra voor Menselijke Erfelijkheid. (2017). Alles goed met mijn baby? Opgehaald van Centrum voor Medische genetica Gent: https://www.cmgg.be/nl/pati%C3%ABnt/brochures

Walton, J. N., & Nattrass, F. J. (1954). On the Classification, Natural History and Treatment of the Myopathies. Brain Vol 77, 169-231.

 

Universiteit of Hogeschool
Biomedische Laboratoriumtechnologie, afstudeerrichting Medische Laboratoriumtechnologie
Publicatiejaar
2017
Promotor(en)
Dr. Sofie Symoens, Centrum voor Medische Genetica Gent
Kernwoorden