The zebrafish (Danio rerio) as a model system to investigate Candida albicans device-associated infections

Shannen Deconinck
Candida albicans: als een vis in het waterHad u ooit gedacht dat een minuscuul visje het leven van duizenden mensen zou kunnen veranderen? Wel, de wetenschap is goed op weg om dit gegeven waar te maken. Zo is de zebravis in staat om zijn eigen hart te genezen en bij nader onderzoek, kan dit misschien een therapie vormen voor mensen met een hartaanval. De zebravis is echter meer dan alleen een onderzoeksobject voor hartziektes. Het is namelijk ook een ideale gastheer om infecties mee te onderzoeken. Infectieziektes zijn de leidende doodsoorzaak bij kinderen en adolescenten.

The zebrafish (Danio rerio) as a model system to investigate Candida albicans device-associated infections

Candida albicans: als een vis in het water

Had u ooit gedacht dat een minuscuul visje het leven van duizenden mensen zou kunnen veranderen? Wel, de wetenschap is goed op weg om dit gegeven waar te maken. Zo is de zebravis in staat om zijn eigen hart te genezen en bij nader onderzoek, kan dit misschien een therapie vormen voor mensen met een hartaanval. De zebravis is echter meer dan alleen een onderzoeksobject voor hartziektes. Het is namelijk ook een ideale gastheer om infecties mee te onderzoeken. Infectieziektes zijn de leidende doodsoorzaak bij kinderen en adolescenten. Zo zijn de Candida species verantwoordelijk voor 65-75% van alle systemische (over het hele lichaam) ziektes. De grote vraag is natuurlijk of we in staat zijn om dergelijke infecties in de zebravis na te bootsen…

Candida albicans, de grote boosdoener

Candida albicans is een schimmel en is niet schadelijk onder normale omstandigheden. Indien er echter een probleem is met het immuunsysteem, kan Candida plots zeer gevaarlijk worden en zelfs de dood tot gevolg hebben. Een andere reden die dit organisme levensbedreigend maakt, is het vermogen om biofilms (driedimensionale, beschermende structuren) te vormen. Een welgekend voorbeeld van biofilms is de vorming van tandplak, mede veroorzaakt door bacteriën. Candida kan echter biofilms vormen op verscheidene medische apparatuur zoals vasculaire katheters, dialyse katheters in het buikvlies en oculaire lenzen. Dit kan leiden tot een verspreiding in de bloedstroom met hoge sterfte tot gevolg. Tot op heden zijn er maar een beperkt aantal medicijnen beschikbaar en bovendien vindt de slimme pathogeen een weg om aan deze geneesmiddelen te ontsnappen. De grote vraag is of we de schade kunnen beperken.

Wij verkozen de zebravislarve tot ‘beste infectiemodel’

Om bovenvermelde redenen waren we tijdens dit project op zoek naar een geschikt proefdier om infecties op ziekenhuisapparatuur te bestuderen. De zebravis was voor dit onderzoek het geschikte modelorganisme om dergelijke infecties te bestuderen. Indien er met zebravislarven gewerkt wordt, is er geen ingewikkeld papierwerk nodig wat een hele hoop tijd uitspaart. Verder zijn de zebravislarven klein wat de huisvesting vergemakkelijkt en een economisch voordeel biedt ten opzichte van muizen en ratten. De transparantie van de larven zorgt ervoor dat de infectie veel makkelijker te bekijken is. Het immuunsysteem van de zebravis kan de menselijke omgeving nabootsen en zo kunnen we meer te weten komen over de verdediging tegen de schimmel.

Candida en de microsferen voelen zich tot elkaar aangetrokken

Om een apparatuur- geassocieerde infectie te imiteren, werd er gebruik gemaakt van sferische latex partikels; microsferen genaamd. Deze microsferen (rood) zijn fluorescent gemerkt en maakt hun zichtbaarheid in de zebravis mogelijk. Ook de Candida cellen waren fluorescent (groen) om zodoende de interactie tussen Candida en de microsferen te kunnen opvolgen. De samenstelling van de microsferen zorgt ervoor dat Candida als een magneet aangetrokken wordt. Deze situatie valt dus te vergelijken met de bezetting van Candida op bijvoorbeeld katheters in de mens.

De zebravis wordt besmet; zal hij overleven?

We injecteerden de microsferen gelijktijdig met de Candida cellen in de zebravislarven en konden op die manier de ontwikkeling van een eventuele infectie op het substraat opvolgen. Candida albicans is in staat om te switchen van gistvorm naar hyfen- (schimmeldraad-) vorm (wildtype), wat deze pathogeen nog gevaarlijker maakt. Om het belang van deze switch na te gaan gebruikten we ook onschadelijke Candida albicans stammen (mutanten) die niet in staat zijn om hyfen te vormen. Als bijkomende controle injecteerden we ook Candida cellen zonder microsferen om het effect van de microsferen tijdens de infectie te bestuderen.Hoewel reeds in het verleden zebravissen geïnfecteerd werden met Candida, waren wij de eersten die transparante zebravislarven gebruikten om de infectie van fluorescente Candida cellen op microsferen op een niet-invasieve manier te volgen op werkelijke tijdsbasis.Candida albicans voelde zich binnenin de zebravissen erg in zijn nopjes aangezien de schimmel in staat was om te groeien en te vermenigvuldigen.Gelukkig gingen de zebravissen niet meteen ten onder aan de infectie, wat er dus op wijst dat de zebravis zich probeert te verweren tegen de pathogeen. We merkten op dat de visjes sneller stierven wanneer ze geïnfecteerd werden met de wildtype Candida cellen (hyfenvorming) vergeleken met de mutant (geen hyfenvorming). De hyfen doen zich dus voor als grote indringers tijdens het infectiemechanisme. Dit was wel in de afwezigheid van de microsferen. Indien we zowel microsferen als mutante Candida injecteerden zagen we dat de visjes sneller stierven dan wanneer de mutante Candida cellen zonder microsferen geïnjecteerd werden. Dit wijst er waarschijnlijk op dat de mutante Candida vorm, door de aanwezigheid van de microsferen, plots schadelijk wordt en zo toch verhoogde sterfte van de zebravissen kan veroorzaken.

De zebravis verzet zich tegen de infectie

Aangezien de zebravis een gelijkaardig immuunsysteem heeft zoals de mens, leek het interessant om te kijken hoe de visjes zouden reageren op de pathogeen. Zouden ze aanvallen of eerder het slachtoffer zijn van een onvermijdelijke Candida albicans infectie? Het antwoord op die vraag kon deels opgelost worden. We gebruikten ditmaal rode Candida cellen aangezien de macrofagen (verdedigers van het immuunsysteem) groen fluorescent waren. De Candida stammen die in staat waren om hyfen te vormen konden aan het immuunsysteem ontsnappen. Indien de zebravissen geïnfecteerd werden met de mutante Candida stammen, dan waren de macrofagen (groene cirkelvormige structuren) in staat om enkele gistcellen te verorberen (rode structuren).

Zebravisplannen in de toekomst

Aan het einde van dit project zijn we erin geslaagd om aan te tonen dat de zebravis een goed modelorganisme is om apparatuur-geassocieerde infecties mee te onderzoeken. We hopen dat ons zebravis infectiemodel een goede leidraad zal zijn in de toekomst om uiteindelijk de ziektes veroorzaakt door Candida beter te begrijpen en deze bijgevolg te kunnen bestrijden.

Met dank aan Prof. Patrick Van Dijck en Dr. Sona Kucharikova (Laboratorium moleculaire celbiologie, KU Leuven, België).

 

Bibliografie

Bibliografie

 

Alby, K., & Bennett, R. J. (2009). Stress-induced phenotypic switching in Candida albicans. Molecular biology of the cell, 20(14), 3178-3191.

Andes, D., Nett, J., Oschel, P., Albrecht, R., Marchillo, K., & Pitula, A. (2004). Development and characterization of an in vivo central venous catheter Candida albicans biofilm model. Infection and immunity, 72(10), 6023-6031.

Berman, J. (2012). Candida albicans. Current biology, 22(16), 620-622.

Bink, A., Kucharikova, S., Neirinck, B., Vleugels, J., Van Dijck, P., Cammue, B. P., & Thevissen, K. (2012). The nonsteroidal antiinflammatory drug diclofenac potentiates the in vivo activity of caspofungin against Candida albicans biofilms. Journal of infectious diseases, 206(11), 1790-1797.

Biocompare. (2006, November 28). Retrieved May 12, 2015, from http://www.biocompare.com/Product-Reviews/40541-FemtoJet-Microinjector-…

Bonhomme, J., & d'Enfert, C. (2013). Candida albicans biofilms: building a heterogeneous, drug-tolerant environment. Current opinion in microbiology, 16(4), 398-403.

Bopp, S. K., Minuzzo, M., & Lettieri, T. (2006). The Zebrafish (Danio rerio): an Emerging model organism in the environmental field. European Commission, Joint Research Centre.

Brand, M., Granato, M., & Nüsslein-Volhard, C. (2002). Keeping and raising zebrafish. In Zebrafish (Vol. 261, pp. 7-37). Oxford University Press.

Brothers, K. M., & Wheeler, R. T. (2012). Non-invasive imaging of disseminated candidiasis in zebrafish larvae. Journal of visualized experiments: JoVE, 65.

Brothers, K. M., Newman, Z. R., & Wheeler, R. T. (2011). Live imaging of disseminated candidiasis in zebrafish reveals role of phagocyte oxidase in limiting filamentous growth. Eukaryotic cell, 10(7), 932-944.

Brunke, S., & Hube, B. (2013). Two unlike cousins: Candida albicans and C. glabrata infection strategies. Cellular microbiology, 15(5), 701-708.

Calderone, A. R., & Fonzi, W. A. (2001). Virulence factors of Candida albicans. Trends in microbiology, 9(7), 327-335.

Chao, C.-C., Hsu, P.-C., Jen, C.-F., Chen, I.-H., Wang, C.-H., Chan, H.-C. et al. (2010). Zebrafish as a model host for Candida albicans infection. Infection and immunity, 78(6), 2512-2521.

Christensen, L. D., Moser, C., Jensen, P. O., Rasmussen, T. B., Christophersen, L., Kjelleberg, S. et al. (2007). Impact of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing on biofilm persistence in an in vivo intraperitoneal foreign-body infection model. Microbiology, 153(7), 2312-2320.

Coenye, T., & Nelis, H. J. (2010). In vitro and in vivo model systems to study microbial biofilm formation. Journal of microbiological methods, 83(2), 89-105.

de Groot, P. W., Bader, O., de Boer, A. D., Weig, M., & Chauhan, N. (2013). Adhesins in human fungal pathogens: glue with plenty of stick. Eukaryotic cell, 12(4), 470-481.

Demuyser, L., Jabra-Rizk, M., & Van Dijck, P. (2014). Microbial cell surface proteins and secreted metabolites involved in multispecies biofilms. Pathogens and disease, 70(3), 219-230.

Dieterich, C., Schander, M., Noll, M., Johannes, F.-J., Brunner, H., Graeve, T., & Rupp, S. (2002). In vitro reconstructed human epithelia reveal contributions of Candida albicans EFG1 and CPH1 to adhesion and invasion. Microbiology, 148(2), 497-506.

Dooley, K., & Zon, L. I. (2000). Zebrafish: a model system for the study of human disease. Current opinion in genetics & development, 10(3), 252-256.

Douglas, J. L. (2003). Candida biofilms and their role in infection. Trends in microbiology, 11(1), 30-36.

EOL Encyclopedia of life. (2015). Retrieved from Danio rerio zebrafish: http://eol.org/pages/204011/overview

Fan, Y., He, H., Dong, Y., & Pan, H. (2013). Hyphae-Specific Genes HGC1, ALS3, HWP1, and ECE1 and relevant signaling pathways in Candida albicans. Mycopathologia, 176(5-6), 329-335.

Fashion Cloud. (2015). Retrieved from http://fashions-cloud.com/pages/z/zebrafish-embryo-stages/

Forche, A., Alby, K., Schaefer, D., Johnson, A. D., Berman, J., & Bennett, R. J. (2008). The Parasexual Cycle in Candida albicans provides an alternative pathway to meiosis for the formation of recombinant strains. PLoS biology, 6(5), e110.

Fu, Y., Ibrahim, A. S., Sheppard, D. C., Chen, Y.-C., French, S. W., Cutler, J. E.et al. Edwards, J. E. (2002). Candida albicans Als1p: an adhesin that is a downstream effector of the EFG1 filamentation pathway. Molecular Microbiology, 44(1), 61-72.

Gillum, A. M., Tsay, E. Y., & Kirsch, D. R. (1984). Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5′-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Molecular and General Genetics MGG, 198(1), 179-182.

Gow, N. A., van de Veerdonk, F. L., Brown, A. J., & Netea, M. G. (2012). Candida albicans morphogenesis and host defence: discriminating invasion from colonization. Nature reviews microbiology, 10(2), 112-122.

Gratacap, R. L., Bergeron, A. C., & Wheeler, R. T. (2014). Modeling mucosal candidiasis in larval zebrafish by swimbladder injection. JoVE (Journal of Visualized Experiments), 93, e52182-e52182.

Gutiérrez-Escibano, P., Zeidler, U., Suárez, M., Bachellier-Bassi, S., Clemante-Blanco, A., Bonhomme, J. et al. (2012). The NDR/LATS kinase Cbk1 controls the activity of the transcriptional regulator Bcr1 during biofilm formation in Candida albicans. PLoS pathogens, 8(5), e1002683.

Howe, K., Clark, M. D., Torroja, C. F., Torrance, J., Berthelot, C., Muffato, M. et al. (2013). The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome. Nature, 496(7446), 498-503.

Jacobsen, I. D., Wilson, D., Wächtler, B., Brunke, S., Naglik, J. R., & Hube, B. (2012). Candida albicans dimorphism as a therapeutic target. Expert review of anti-infective therapy, 10(1), 85-93.

Keppler-Ros, S., Noffz, C., & Dean, N. (2008). A New Purple Fluorescent Color Marker for Genetic Studies in Saccharomyces cerevisiae and Candida albicans. Genetics, 179(1), 705-710.

Kim, J., & Sudbery, P. (2011). Candida albicans, a major human fungal pathogen. The journal of microbiology, 49(2), 171-177.

Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., & Schilling, T. F. (1995). Stages of Embryonic Development of the Zebrafish. Developmental dynamics, 203(3), 253-310.

Kucharikova, S., Sharma, N., Spriet, I., Maertens, J., Van Dijck, P., & Lagrou, K. (2013). Activities of systemically administered echinocandins against in vivo mature Candida albicans biofilms developed in a rat subcutaneous model. Antimicrobial agents and chemotherapy, 57(5), 2365-2368.

Kucharikova, S., Tournu, H., Holtappels, M., Van Dijck, P., & Lagrou, K. (2010). In vivo efficacy of anidulafungin against mature Candida albicans biofilms in a novel rat model of catheter-associated Candidiasis. Antimicrobial agents and chemotherapy, 54(10), 4474-4475.

Kucharikova, S., Tournu, H., Lagrou, K., Van Dijck, P., & Bujdakova, H. (2011). Detailed comparison of Candida albicans and Candida glabrata biofilms under different conditions and their susceptibility to caspofungin and anidulafungin. Journal of medical microbiology, 60(9), 1261-1269.

Kucharikova, S., Vande Velde, G., Himmelreich, U., & Van Dijck, P. (2015). Candida albicans biofilm development on medically-relevant foreign bodies in a mouse subcutaneous model followed by bioluminescence imaging. Journal of visualized experiments.

Kuhn, D. M., Balkis, M., Chandra, J., Mukherjee, P. K., & Ghannoum, M. A. (2003). Uses and limitations of the XTT assay in studies of Candida growth and metabolism. Journal of clinical microbiology, 41(1), 506-508.

Kuo, Z.-Y., Chuang, Y.-J., Chao, C.-C., Liu, F.-C., Lan, C.-Y., & Chen, B.-S. (2012). Identification of infection-and defense-related genes via a dynamic host-pathogen interaction network using a Candida albicans-zebrafish infection model. Journal of innate immunity, 5(2), 137-152.

LaFleur, M. D., Kumamoto, C. A., & Lewis, K. (2006). Candida albicans biofilms produce antifungal-tolerant persister cells. Antimicrobial agents and chemotherapy, 50(11), 3839-3846.

Lazzell, A. L., Chaturvedi, A. K., Pierce, C. G., Prasad, D., Uppuluri, P., & Lopez-Ribot, J. L. (2009). Treatment and prevention of Candida albicans biofilms with caspofungin in a novel central venous catheter murine model of candidiasis. Journal of antimicrobial chemotherapy, 64(3), 567-570.

Levraud, J.-P., Palha, N., Langevin, C., & Boudinot, P. (2014). Through the looking glass: witnessing host-virus interplay in zebrafish. Trends in microbiology, 9, 490-497.

Liu, Y., & Filler, S. G. (2011). Candida albicans Als3, a multifunctional adhesin and invasin. Eukaryotic Cell, 10(2), 168-173.

Lo, H.-J., Kohler, J. R., DiDomenico, B., Loebenberg, D., Cacciapuoti, A., & Fink, G. R. (1997). Nonfilamentous C. albicans mutants are avirulent. 90(5), 939-949.

Mayer, F. L., Wilson, D., & Hube, B. (2013). Candida albicans pathogenicity mechanisms. Virulence, 4(2), 119-128.

McBain, A. J. (2009). In Vitro biofilm models: an overview. In Advances in applied microbiology (Vol. 69, pp. 99-132).

Meijer, A. H., & Spaink, H. P. (2011). Host-pathogen interactions made transparent with the zebrafish model. Current drug targets, 12(7), 1000-1017.

Mitchell, K. F., Zarnowski, R., Sanchez, H., Edward, J. A., Reinicke, E. L., Nett, J. E. et al. (2015). Community participation in biofilm matrix assembly and function. PNAS, 112(13), 4092-4097.

Mohandas, V., & Ballal, M. (2011). Distribution of Candida species in different clinical samples and their virulence : biofilm formation, proteinase and phospholipase production: a study on hospitalized patients in Southern India. Journal of global infectious diseases, 3(1), 4.

Nett, J. E., Brooks, E. G., Cabezas-Olcos, J., Sanchez, H., Zarnowski, R., Marchillo , K., & Andes, D. R. (2014). Rat indwelling urinary catheter model of Candida albicans biofilm. Infection and immunity, 82(12), 4931-4940.

Nett, J. E., Marchillo, K., Spiegel, C. A., & Andes, D. R. (2010a). Development and validation of an in vivo Candida albicans biofilm denture model. Infection and immunity, 78(9), 3650-3659.

Nett, J. E., Sanchez, H., Cain, M. T., & Andes, D. R. (2010b). Genetic basis of Candida biofilm resistance due to drug-sequestering matrix glucan. Journal of Infectious Diseases, 202(1), 171-175.

Nobile, C. J., & Mitchell, A. P. (2005). Regulation of cell-surface genes and biofilm formation by the C. albicans transcription factor Bcr1p. Current Biology, 15(12), 1150-1155.

Nobile, C. J., Andes, D. R., Nett, J. E., Smith, Jr, F. J., Yue, F., Phan, Q.-T. et al. (2006). Critical role of Bcr1-dependent adhesins in C. albicans biofilm formation in vitro and in vivo. PLoS pathogens, 2(7), e63.

Nobile, C. J., Schneider, H. A., Nett, J. E., Sheppard, D. C., Filler, S. G., Andes, D. R., & Mitchell, A. P. (2008). Complementary adhesin function in C. albicans biofilm formation. Current biology, 18(14), 1017-1024.

Pande, K., Chen , C., & Noble, S. M. (2013). Passage through the mammalian gut triggers a phenotypic switch that promotes Candida albicans commensalism. Nature genetics, 45(9), 1088-1091.

Peters, B. M., & Noverr, M. C. (2013). Candida albicans-Staphylococcus aureus polymicrobial peritonitis modulates host innate immunity. Infection and immunity, 81(6), 2178-2189.

Peters, B. M., Ovchinnikova, E. S., Krom, B. P., Schlecht, L., Zhou, H., Hoyer, L. L.et al. (2012). Staphylococcus aureus adherence to Candida albicans hyphae is mediated by the hyphal adhesin Als3p. Microbiology, 158(Pt 12), 2975-2986.

Pierce, C. G., Uppuluri, P., Tristan, A. R., Wormley Jr., F. L., Mowat, E., Ramage, G., & Lopez-Ribot, J. L. (2008). A simple and reproducible 96 well plate-based method for the formation of fungal biofilms and its application to antifungal susceptibility testing. Nature protocols, 3(9), 1494-1500.

Ramage, G., Jose, A., Sherry, L., Lappin, D., Jones, B., & Williams, C. (2013). Liposomal amphotericin B displays rapid dose-dependent activity against Candida albicans biofilms. Antimicrobial agents and chemotherapy, 57(5), 2369-2371.

Reed, B., & Jennings, M. (2011). Guidance on the housing and care of zebrafish Danio rerio. Research Animals Department, Science Group, RSPCA.

Renshaw, S. A., & Trede, N. S. (2012). A model 450 million years in the making: zebrafish and vertebrate immunity. Disease models & mechanisms, 5(1), 38-47.

Renshaw, S. A., Loynes, C. A., Trushell, D. M., Elworthy, S., Ingham, P. W., & Whyte, M. K. (2006). A transgenic zebrafish model of neutrophilic inflammation. Blood, 108(13), 3976-3978.

Ricicova, M., Kucharikova, S., Tournu, H., Hendrix, J., Budjakova, H., Van Eldere, J. et al. (2010). Candida albicans biofilm formation in a new in vivo rat model. Microbiology, 156(3), 909-919.

Schaller, M., Borelli, C., Korting, H. C., & Hube, B. (2005). Hydrolytic enzymes as virulence factors of Candida albicans. Mycoses, 48(6), 365-377.

Shinde, R. B., Raut, J. S., & Karuppayil, M. S. (2012). Biofilm formation by Candida albicans on various prosthetic materials and its fluconazole sensitivity: a kinetic study. Mycoscience, 53(3), 220-226.

Shirtliff, M. E., Peters, B. M., & Jabra-Rizk, M. (2009). Cross-kingdom interactions: Candida albicans and bacteria. FEMS microbiology letters, 299(1), 1-8.

Staveley, B. E. (2015). Molecular & developmental biology. Retrieved May 13, 2015, from http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL3530/DEVO_03/devo_03.html

Sudbery, P., Gow, N., & Berman, J. (2004). The distinct morphogenic states of Candida albicans. Trends in microbiology, 12(7), 317-324.

Sullivan, C., & Kim, C. H. (2008). Innate immune system of the zebrafish, Danio rerio. In Innate immunity of plants, animals, and humans (Vol. 21, pp. 113-133). Springer.

Tobin, D. M., May, R. C., & Wheeler, R. T. (2012). Zebrafish: A see-through host and a fluorescent toolbox to probe host–pathogen interaction. PLoS pathogens, 8(1), e1002349.

Torraca, V., Masud, S., Spaink, H. P., & Meijer, A. H. (2014). Macrophage-pathogen interactions in infectious diseases: new therapeutic insights from the zebrafish host model. Disease models & mechanisms, 7(7), 785-797.

Tournu, H., & Van Dijck, P. (2011). Candida biofilms and the host: models and new concepts for eradication. International journal of microbiology, 2012.

van der Sar, A. M., Stockhammer, O. W., van der Laan, C., Spaink, H. P., Wilbert, B., & Meijer, A. H. (2006). MyD88 innate immune function in a zebrafish embryo infection model. Infection and immunity, 74(4), 2436-2441.

Vande Velde, G., Kucharikova, S., Schrevens, S., Himmelreich, U., & Van Dijck, P. (2014). Towards non‐invasive monitoring of pathogen–host interactions during Candida albicans biofilm formation using in vivo bioluminescence. Cellular microbiology, 16(1), 115-130.

Veneman, W. J., Stockhammer, O. W., de Boer, L., Zaat, S. A., Meijer, A. H., & Spaink, H. P. (2013). A zebrafish high throughput screening system used for Staphylococcus epidermidis infection marker discovery. BMC genomics, 14(1), 255.

Yannai, S., Berdicevsky, I., Duek , L. (1991). Transformations of inorganic mercury by Candida albicans and Saccharomyces cerevisiae. Applied and environmental microbiology, 57(1), 245-247.

Zhu, W., & Filler, S. G. (2010). Interaction of Candida albicans with epithelial cells. Cellular Microbiology, 12(3), 273-282.

 

 

Universiteit of Hogeschool
Biochemie- Biotechnologie
Publicatiejaar
2015
Kernwoorden