Ontwikkeling van een expressiesysteem voor de productie van het "Ice Nucleation Protein"

Tim Goelen
Bacteriën laten water sneller bevriezenBevriezen van water is duurIn tegenstelling tot wat de meeste mensen denken, bevriest water niet bij 0°C. Het water kan echter afgekoeld worden tot ver onder het nulpunt vooraleer er effectief ijs gevormd wordt. Zo kunnen kleine volumes ultrazuiver water afgekoeld worden tot een temperatuur van -40°C voordat bevriezing optreedt. Enkel bij oneffenheden in het recipiënt of aanwezigheid van onzuiverheden of vreemde partikels in het water, kan het water bevriezen bij een hogere temperatuur.

Ontwikkeling van een expressiesysteem voor de productie van het "Ice Nucleation Protein"

Bacteriën laten water sneller bevriezen

Bevriezen van water is duur

In tegenstelling tot wat de meeste mensen denken, bevriest water niet bij 0°C. Het water kan echter afgekoeld worden tot ver onder het nulpunt vooraleer er effectief ijs gevormd wordt. Zo kunnen kleine volumes ultrazuiver water afgekoeld worden tot een temperatuur van -40°C voordat bevriezing optreedt. Enkel bij oneffenheden in het recipiënt of aanwezigheid van onzuiverheden of vreemde partikels in het water, kan het water bevriezen bij een hogere temperatuur. In de meeste installaties moet het water afgekoeld worden tot ongeveer -10°C om ijsvorming te bekomen.  Doordat water niet bevriest op het nulpunt heeft dit een nadelig effect op toepassingen waarbij ijs gevormd moet worden. Hierdoor is er bijvoorbeeld veel koelingsenergie nodig om kunstsneeuw aan te maken of een ijspiste aan te leggen.

Wanneer er aan water onzuiverheden worden toegevoegd, kan de benodigde koeling gereduceerd worden. Zo voegde men vroeger mineraalzouten, zoals zilverjodide, toe aan het water om goedkoper sneeuw te kunnen maken. Dit was mogelijk doordat deze zouten een kristalstructuur hebben die zeer sterk gelijkt op die van ijskristallen. Hierdoor kunnen de watermoleculen zich afzetten op de zoutkristallen waardoor het water makkelijker bevriest. Dit zorgt ervoor dat het water afgekoeld moet worden tot slechts -8°C. Omdat veelvuldig gebruik van dergelijke mineraalzouten een negatieve invloed heeft op mens en natuur, werd het gebruik er van snel opgeschort en is er dus nood aan een duurzaam alternatief om ijsvorming te versnellen. 

Bacterieel proteïne als ijsmaker

Nu blijkt dat er verschillende soorten bacteriën zijn die een eiwit kunnen aanmaken dat water bij een hogere temperatuur kan laten bevriezen. Deze bacteriën komen in de natuur voor op de bladeren van verschillende planten. Het bezit van dit eiwit biedt de bacteriën enkele voordelen. Onder normale omstandigheden kunnen vorstgevoelige planten tegen temperaturen onder het nulpunt. Echter wanneer nu deze bacteriën op die planten aanwezig zijn, kan dit vorstschade veroorzaken. Deze vorstschade is het gevolg van het scheuren van plantencellen door de vorming van het ijs, waardoor de inhoud van de plantencel vrijkomt en als voedingsbron gebruikt kan worden door de bacterie.

Deze bacteriën produceren het zogenaamde Ice Nucleation Protein (INP). Door dit eiwit kunnen de bacteriën water bevriezen bij temperaturen van slechts -2,5°C. Een eiwit bestaat uit een aaneenschakeling van verschillende bouwstenen, die men aminozuren noemt. Elk eiwit bestaat uit een unieke aaneenschakeling van deze aminozuren. Uit onderzoek is gebleken dat de structuur en de opeenvolging van de bouwstenen (aminozuren) van het Ice Nucleation Proteïne, afkomstig van verschillende bacteriën, zeer sterk op elkaar gelijken. Bovendien hebben alle teruggevonden INPs een centraal domein dat bestaat uit een bepaald aminozuurpatroon, bestaande uit 8 aminozuren dat een 30-tal keer achter elkaar herhaald wordt. Dit geeft aan dat deze opeenvolging zeer belangrijk is om het water te kunnen laten bevriezen. Zo zou het eiwit dienst doen als een sjabloon om watermoleculen te ordenen in een ijskristal.  

Productie uitbesteden aan andere bacterie

Het is duidelijk dat het gebruik van bacteriën die een INP aanmaken, voordelen kan bieden ten opzichte van mineraalzouten in tal van processen waarin ijsvorming beoogd wordt. Ten eerste kunnen ze het water bevriezen bij hogere temperaturen. Dit zou kunnen zorgen voor verdere besparing van energie nodig voor koeling. Ten tweede zijn deze eiwitten natuurlijke producten en onschadelijk voor mens en natuur. Echter niet elke bacterie kan met behulp van zijn INP het water bevriezen bij eenzelfde temperatuur. Daarom werd in een eerste fase van dit onderzoek een 100-tal verschillende bacteriën gescreend op de aanwezigheid van een gen dat codeert voor het INP. Vervolgens werd nagegaan bij welke temperatuur deze bacteriën ijsvorming kunnen induceren.

In natuurlijke omstandigheden wordt het INP echter aangemaakt in relatief beperkte hoeveelheden. Om dit INP in te kunnen zetten in industriële toepassingen, is bijgevolg een hogere productie nodig. In een tweede fase van dit onderzoek werd verder gewerkt met een bacterie die bij de hoogste temperatuur ijsvorming kan induceren en werd de genetische informatie die codeert voor het INP lichtjes aangepast en in een andere bacterie gebracht.

Op deze manier kan de productie van het gewenste Ice Nucleation Protein uitgevoerd worden door een andere bacterie, Escherichia coli (E. coli). Deze darmbacterie wordt veel gebruikt voor de productie van zogenaamde recombinante eiwitten omdat E. coli makkelijk manipuleerbaar is, genetisch goed gekend is, snel groeit en groeit op goedkope grondstoffen. Hierdoor is de opgroei van deze bacterie en dus ook de productie van het INP goedkoper.

In dit onderzoek zijn we er dus in geslaagd om een nieuw systeem te ontwikkelen waardoor E. coli in staat is om het Ice Nucleation Protein te produceren in grotere hoeveelheden.  Hierdoor vertoont deze gemanipuleerde E. coli zelfs een hogere activiteit dan de natuurlijke organismen en kan het water bevriezen bij een temperatuur van-2,5°C. Door de hogere activiteit zijn er bovendien minder bacteriën nodig om éénzelfde volume water te bevriezen.

Op basis van deze nieuwe, gemanipuleerde bacterie is het dus mogelijk om nieuwe, efficiëntere producten aan te maken om water goedkoper en sneller te laten bevriezen. Daarenboven kan via dit nieuwe productiesysteem het eiwit zelf snel en goedkoop opgezuiverd worden, waardoor het afzonderlijk gebruikt kan worden in plaats van de bacteriën. Gezien het gebruik van genetisch gemodificeerde organismen (GGO) strikt gereglementeerd is en de publieke opinie eerder terughoudend is rond het gebruik van GGO’s, biedt een opgezuiverd proteïne meer mogelijkheden voor toepassingen. Zo kan het INP in de toekomst mogelijk gebruikt worden om voedingswaren of koelelementen sneller, goedkoper en duurzamer in te vriezen. Daarnaast heeft het een groot potentieel om ijspistes aan te leggen met minder verbruik van (koelings)energie of het kan ook gebruikt worden in sneeuwkanonnen. Hierdoor is het mogelijk dat wanneer je nog eens gaat skiën of schaatsen je dit op sneeuw of ijs doet dat werd aangemaakt met de hulp van deze bacteriën.

 

Bibliografie

Ahern, H.E., Walsh, K.A., Hill, T.C.J., en Moffett, B.F. (2007). Fluorescent pseudomonads isolated from Hebridean cloud and rain water produce biosurfactants but do not cause ice nucleation. Biogeosciences. 4(1):115-124. Buttner, M.P., en Amy, P.S. (1989). Survival of Ice Nucleation-Active and genetically engineered non-ice-nucleating Pseudomonas syringae strains after freezing. Applied and environmental microbiology. 55(7):1690-1694. Chen, Q.S., Liu, J.H., en Yan, Y.L. (2002). Application of ice nucleation active membrane debris on partially frozen of shrimp. Food Science. 23(11):139–143. Cochet, N., en Clausse, D. (1994). Ice nucleation by bacteria : production and activity. Colloids and surfaces a: physicochemical and engineering aspects. 83:187-191. Cochet, N., en Widehem, P. (2000). Ice crystallization by Pseudomonas syringae. Applied Microbiology and Biotechnology. 54(2):153-161. Davies, P.L. (2014). Ice-binding proteins: a remarkable diversity of structures for stopping and starting ice growth. Trends in Biochemical Sciences. 39(11):548-555. Edwards, A.R., Van Den Bussche, R.A., Wichman, H.A., en Orser, C.S. (1994). Unusual Pattern of Bacterial Ice Nucleation Gene Evolution. Molecular Biology and Evolution. 11(6):911-920. Garnham, C.P., Campbell, R.L., Walker, V.K., en Davies, P.L. (2011). Novel dimeric β-helical model of an ice nucleation protein with bridged active sites. BMC structural biology. 11(1):36-47. Hazra, A., Sahaa, M., Dea, U.K., Mukherjeea, J., en Goswamib K. (2004). Study of ice nucleating characteristics of Pseudomonas aeruginosa. Journal of Aerosol Science. 35(11):1405-1414. Hill, T.C.J., Moffett, B.F., DeMott, P.J., Georgakopoulos, D.G., Stump, W.L., en Franc, G.D. (2014). Measurement of ice nucleation-active bacteria on plants and in precipitation by quantitative PCR. Applied and environmental microbiology. 80(4):1256-1267. iGEM. (2011). iGEM: Registry of Standard Biological Parts. Part:BBa_K584024. http://parts.igem.org/Part:BBa_K584024. Geraadpleegd op 28 april 2015. iGEM. (2011). iGEM: Registry of Standard Biological Parts. Part:BBa_K584027. http://parts.igem.org/Part:BBa_K584027. Geraadpleegd op 28 april 2015. Ishikawa M., Kishimoto, T., Kuchitsu, H., Murakawa, H., Price, W.S., Saruwatari, A., Sekozawa, Y., en Yamazaki, H. (2014). High ice nucleation activity located in blueberry stem bark is linked to primary freeze initiation and adaptive freezing behaviour of the bark. AoB plants. 6:1-17. Joly, M., Attard, E., Sancelme, M., Deguillaume, L., Guilbaud, C., Morris, C.E., Amato, P., en Delort, A. (2013). Ice nucleation activity of bacteria isolated from cloud water. Atmospheric Environment. 70:392-400. Jung, H., Park, J., Park, S., Lebeault, J., en Pan, J. (1998). Expression of carboxymethylcellulase on the surface of Escherichia coli using Pseudomonas syringae ice nucleation protein. Enzyme and microbial technology. 22(5):348-354. Kajava, A.V., en Lindow, S.E. (1993). A Model of the Three-dimensional Structure of Ice Nucleation Proteins. Journal of Molecular Biology. 232:709-717. Kasper, J., en Fries, W. (2011). The freezing step in lyophilization: physico-chemical fundamentals, freezing methods and consequences on process performance and quality attributes of biopharmaceuticals. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics. 78(2):248-263. Kiani, H., en Sun, D. (2011). Water crystallization and its importance to freezing of foods: A review. Trends in Food Science & Technology. 22(8):407-426. Kozloff, L., Schofield, M., en Lute, M. (1983). Ice Nucleating Activity of Pseudomonas syringae and Erwinia herbicola. Journal of Bacteriology. 153(1):222-231. Kumaki, Y., Kawano, K., Hikichi, K., Matsumoto, T., en Matsushima, N. (2008). A circular loop of the 16-residue repeating unit in ice nucleation protein. Biochemical and biophysical research Communications. 371(1):5-9. Lagriffoul, A., Boudenne, J.L., Absi, R., Ballet, J.J., Berjeaud, J.M., Chevalier, S., Creppy, E.E., Gilli, E., Gadonna, J.P., Gadonna-Widehem, P., Morris, C.E., en Zini, S. (2010). Bacterial-based additives for the production of artificial snow: What are the risks to human health? The Science of the total environment. 408(7):1659-1666. Lee S.K., en Keasling, J.D. (2005). A Propionate-Inducible Expression System for Enteric Bacteria A Propionate-Inducible Expression System for Enteric Bacteria. Applied and environmental microbiology. 71(11):6856-6862. Li, L., Kang, D., en Cha, H. (2003). Functional display of foreign protein on surface of Escherichia coli using N-terminal domain of ice nucleation protein. Biotechnology and bioengineering. 85(2):214-221. Li, J., en Lee, T. (1995). Bacterial ice nucleation and its potential application in the food industry. Trends in Food Science & Technology. 6:259-265. Li, Q., Yan, Q., Chen, J., He, Y., Wang, J., Zhang, H., Yu, Z., en Li, L. (2012). Molecular characterization of an ice nucleation protein variant (inaQ) from Pseudomonas syringae and the analysis of its transmembrane transport activity in Escherichia coli. International journal of biological sciences. 8(8):1097-1108. Lindow, S.E. (1983). The role of bacterial ice nucleation in frost injury to plants. Annual Review of Phytopathology. 21:363-84. Lindow, S.E., Arny, D.C., en Upper, C.D. (1978). Distribution of ice nucleation-active bacteria on plants in nature. Applied and environmental microbiology. 36(6):831-838. Lindow, S.E., Leveau, J.H.J., en Loper, J.E. (2007). Reporter gene systems useful in evaluation in situ gene expression by soil- and plant-associated bacteria. In: Manual ofEnvironmental Microbiology, Third Edition. Hurst, C.J., Crawford, R.L., Lipson, D.A., Mills, A.L., en Stetzenbach, L.D. (Eds). p. 734-747. American Society for Microbiology Press, Washington DC. Lynn, S., Noto, G.D., en Brandes, J. (1988). Fermentation of microorganisms having ice nucleating activity using a defined medium. EU patent0272669A2. Mizuno, H. (1989). Prediction of the Conformation of Ice-Nucleation Protein by Conformational Energy Calculation. Proteins: Structure, Function, and Genetics. 5:47-65. Möhler, O., Georgakopoulos, D.G., Morris, C.E., Benz, S., Ebert, V., Hunsmann, S., Saathoff, H., Schnaiter, M., en Wagner, R. (2008). Heterogeneous ice nucleation activity of bacteria : new laboratory experiments at simulated cloud conditions. Biogeosciences. 5:1425-1435. Morris, C.E., Sands, D.C., Vinatzer, B.A., Glaux, C., Guilbaud, C., Buffière, A., Yan, S., Dominguez, H., en Thompson, B.M. (2008). The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle. The ISME journal. 2(3):321-334. Mullin, J.W. (2001). Primary nucleation. In: Crystallization, 4th Edition. p. 182-184. Butterworth-Heinemann, Oxford. Nejad, P., Ramstedt, M., Granhall, U., Roos, S., en McIvor, I. (2006). Biochemical characterization and identification of ice-nucleation-active (INA) willow pathogens by means of BIOLOG® MicroPlate, INA gene primers and PCR-based 16S rRNA gene analyses. Journal of Plant Diseases and Protection. 113(3):97-106. Nemecek-marshall, M., Laduca, R., en Fall, R. (1993). High-level expression of ice nuclei in a Pseudomonas syringae strain is induced by nutrient limitation and low temperature. Journal of bacteriology. 175(13):4062-4070. Pattnaik, P., Batish, V.K., Grover, S., en Ahmed, N. (1997). Bacterial nucleation: Prospects and perspectives. Current Science. 72(5):316-320. Phelps, P., Giddings, T.H., Prochoda, M., en Fall, R.A.Y. (1986). Release of Cell-Free Ice Nuclei by Erwinia herbicola. Journal of bacteriology. 167(2):496-502. Šantl-Temkiv, T., Sahyoun, M., Finster, K., Hartmann, S., Augustin-Bauditz, S., Stratmann, F., Wex, H., Clauss, T., Nielsen, N.W., Sørensen, J.H., Korsholm, U.S., Wick, L.Y., en Karlson, U.G. (2015). Characterization of airborne ice-nucleation-active bacteria and bacterial fragments. Atmospheric Environment. 109:105-117. Schnell, R.C., en Vali, G. (1976). Biogenic Ice Nuclei: Part I. Terrestrial and Marine Sources. Hournal of The Atmospheric Sciences. 33:1554-1564. Skirvin, R.M., Kohler, E., Steiner, H., Ayers, D., Laughnan, A., Norton, M.A., en Warmund, M. (2000). The use of genetically engineered bacteria to control frost on strawberries and potatoes. Whatever happened to all of that research? Scientia Horticulturae. 84:179-189. Skwarek, L.C., en Boulianne, G.L. (2009). Great Expectations for PIP: Phosphoinositides as Regulators of Signaling During Development and Disease. Developmental Cell. 16:12-20. Sun, D., en Zheng, L. (2006). Innovations in Freezing Process. In: Handbook of Frozen Food Processing and Packaging. Sun, D. (Ed). p. 175-192. Taylor & Francis Group, New York. Sundin, G., en Rothwell, N. (2010). Michigan State University Extension, Department of Plant, Soil and Microbial Sciences. Bacterial canker, ice nucleation, frost injury and blossom blast in sweet cherries. http://msue.anr.msu.edu/news/bacterial_canker_ice_nucleation_frost_inju…. Geraadpleegd op 4 november 2014. Thermo Fisher Scientific. (2015). B-PER™ Bacterial Protein Extraction Reagent. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/78248. Geraadpleegd op 5 mei 2015. Thermo Fisher Scientific. (2015). Platinum® Pfx DNA Polymerase. https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11708013. Geraadpleegd op 4 mei 2015. Turner, M.A., Arellano, F., en Kozloff, M.L. (1991). Components of ice nucleation structures of bacteria. Journal of Bacteriology. 173(20):6515-6527.Vali, G. (1971). Quantitative evaluation of experimental results on the heterogeneous freezing nucleation of supercooled liquids. Journal of the atmospheric sciences. 28:402-409. van Bloois, E., Winter, R.T., Kolmar, H., en Fraaije, M.W. (2011). Decorating microbes: surface display of proteins on Escherichia coli. Trends in biotechnology. 29(2):79-86. Wantanabe, M., en Arai, S. (1994). Bacterial ice-nucleation activity and its application to freeze concentration of fresh foods for modification of their properties. Joumal of Food Engineering. 22(4):453-473. Warren, G., Corotto, L., en Wolber, P. (1986). Conserved repeats in diverged ice nucleation proteins structural genes from two species of Pseudomonas syringae. Nucleic acids Res. 14:8047-8060. Wilson, P.W., Heneghan, A.F., en Haymet, A.D.J. (2003). Ice nucleation in nature: supercooling point (SCP) measurements and the role of heterogeneous nucleation. Cryobiology. 46:88-98. Widehem, P., en Cochet, N. (2003). Pseudomonas syringae as an ice nucleator—application to freeze-concentration. Process Biochemistry. 39(4):405-410. Woerpel, M.D. (1980). Snow making. US Patent4200228. Wolber, P.K. (1993). Bacterial Ice Nucleation. In: Advances in Microbial Physiology, volume 34. Rose, A.H. (Ed). p. 203-235. Academic Press Limited, London. Wu, P., Giridhar, R., en Wu, W. (2006). Surface Display of Transglucosidase on Escherichia coli by Using the Ice Nucleation Protein of Xanthomonas campestris and ItsApplication in Glucosylation of Hydroquinone. Biotechnology and Bioengineering. 95(6):1138-1147. Wu, Z., Qin, L., en Walker, V. (2009). Characterization and recombinant expression of a divergent ice nucleation protein from 'Pseudomonas borealis'. Microbiology (Reading, England). 155:1164-1169. Yang, C., Cai, N., Dong, M., Jiang, H., Li, J., Qiao, C., Mulchandani, A., en Chen, W. (2008). Surface display of MPH on Pseudomonas putida JS444 using ice nucleation protein and its application in detoxification of organophosphates. biotechnology and bioengineering. 99(1):30-37. Zhang, S., Wang, H., en Chen, G. (2009). Effects of Pseudomonas syringae as bacterial ice nucleator on freezing of model food. Journal of Food Engineering. 94(4):248-253. Zhang, S., Wang, H., en Chen, G. (2010). Addition of ice-nucleation active bacteria: Pseudomonas syringae pv. panici on freezing of solid model food. Food Science and Technology. 43(9):1414-1418.

Universiteit of Hogeschool
Industriële Ingenieurswetenschappen: Biotechnologie
Publicatiejaar
2015
Kernwoorden